参松养心胶囊对心室肌细胞钾通道的影响

李宁吴相锋马克娟赵新然吴以岭浦介麟 2007-4-6 0:31:07 《疑难病杂志》 2007 年 3 月第 6 卷第 3 期

　　【摘要】目的观察参松养心胶囊干粉提取溶液对大鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)以及豚鼠心肌细胞延迟整流钾电流(Ik)的影响。方法用酶解法分离单个心室肌细胞，并用全细胞膜片钳记录技术。结果当药物浓度0.5%时，可以使大鼠心肌细胞IK1内向成分降低，使-100 mV时IK1电流密度从(-10.8±1.8)pA/pF降至(-7.2±2.1)pA/pF，平均抑制率为(33.1±16.9)%(n=11，P＜0.05)，但不改变电流的翻转电位及整流特性。药物同时对Ito电流的瞬时成分有抑制作用，60 mV时Ito电流密度从(-19.8±7.1)pA/pF降至(-10.0±3.9)pA/pF，平均抑制率为(50.6±10.8)%(n=6，P＜0.05)，稳态失活曲线左移，失活后恢复时间常数增大。药物浓度0.5%时，对Ik有电压依赖性抑制作用，50 mV时对尾电流峰值的抑制率为(30.8±1.1)%(n=5，P＜0.05)。结论参松养心胶囊干粉提取溶液对IK1，Ito和Ik均具有不同程度的阻滞作用，这可能是其抗心律失常药理机制的一部分。

　　【关键词】参松养心胶囊；膜片钳；钾离子通道；心室肌细胞；大鼠

The effect of Shensongyangxin capsule on potassium channel currents in isolated ventricular myocytes LI Ning,MA Kejuan,PU Jielin.Center for Arrhythmia Diagnosis and Treatment,Fuwai Cardiovascular Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100037,China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of Shensonyangxincapsule on inward rectifier potassium currents (IK1),transient outward potassium current (Ito) and delayed rectifier current (Ik) in ventricular myocytes.Methods Whole cell patch-clamp technique was used to observe potassium currents in enzymatically isolated ventricular myocytes of rat or guinea-pig.Results Shensongyangxin capsule decreased the inward current of IK1 by 33.1% when test potential was -100 mV,but which had little effect on the reversal potential and the rectified property.The drug also inhibited the transient component of Ito by 50.6 % at 60 mV while which shifted the inactive curve negatively and prolonged the recovery time after channel inactivation.The density of Ik tail current was decreased by 30.77±1.11% (n=5,P＜0.05) at 50 mV after the drug was used.Conclusion Shensongyangxin capsule can block Ik1 ,Ito and Ik,which may contribute to its antiarrhythmic effect.

　　【Key words】 Shensongyangxin capsule；Patch clamp；Potassium channel；Ventricular myocytes；Rat

参松养心胶囊能明显抑制药物诱发的心律失常并对缺血再灌注所致心律失常有明显的保护作用。随机双盲临床试验显示，参松养心胶囊治疗冠心病心律失常有明显疗效［1］。但未见对心肌细胞离子通道影响的报道。钾离子通道是影响细胞膜复极的重要通道，本研究采用全细胞膜片钳记录技术,探讨了参松养心胶囊对大鼠单个心室肌细胞钾离子通道内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)及豚鼠IK钾离子通道的影响,了解其药理作用的电生理机制，为其临床应用提供和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：参松养心胶囊提取干粉，由石家庄以岭药业股份有限公司提供。II型胶原酶(collagenase II)为Gibico 公司产品。链蛋白酶E为Merck公司产品。N2羟乙基哌嗪N'2乙磺酸(HEPES)、乙二醇—双四乙酸(EGTA)、L谷氨酸(LGlutamic acid)、牛磺酸(taurine)、天门冬氨酸、磷酸肌酸二钠、氯化胆碱(cholineCl)、CaCl2、K2ATP为Sigma公司产品。4氨基吡啶(4AP) 为Fluka公司产品。其余试剂为国产分析纯，由北京化学试剂公司提供。

1.1.2 溶液：

1.1.2.1 无钙台氏液(mmol/L) NaCl 136、KCl 5.4、MgCl2 1.0、NaH2PO4 0.33、HEPES 10、Glucose 10，用NaOH调pH至7.4。

1.1.2.2 KB液(mmol/L) KCl 40、KH2PO4 20、MgSO4 3.0、KOH 80、L谷氨酸50、牛磺酸20、HEPES 10、Glucose 10、EGTA 0.5，用KOH调pH至7.4。

1.1.2.3 记录全细胞钾电流的灌流液(mmol/L) CholineCl 136、MgCl2 1.2 、KCl 5.4、NaH2PO4 0.33、CaCl2 1.8,CdCl2 0.15，HEPES 10、Glucose 10，用LiOH调pH至7.4。记录Ik时加1 mmol/L BaCl2以阻断Ik1电流。

1.1.2.4 记录全细胞钾电流的电极内液(mmol/L) 天门冬氨酸钾 120、KCl 20、HEPES 5、MgCl2 1.0、K2ATP 4、EGTA 10、磷酸肌酸二钠2，用KOH调pH至7.3。所用电极内液均经过直径0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.1.2.5 参松养心胶囊溶液的配制将参松养心胶囊提取干粉，先用无KCl的细胞外灌流液配制成质量为5%溶液，再调整K+浓度至5.4 mmol/L，离心取上层溶液备用。

1.1.3 动物：雄性SD大鼠及豚鼠，体重均为250～300 g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 单个心肌细胞的分离：参考文献［2～4］并加以改进，用急性酶解法制备心室肌单个细胞。以50 mg/kg戊巴比妥钠予大鼠腹腔注射麻醉后，开胸取出心脏，在4℃无钙台氏液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，行Langendorff心脏灌流。先以无钙台氏液灌流3 min。用低钙酶解液(CaCl2 为0.05 mmol/L低钙台氏液，含II型胶原酶0.4 mg/ml，蛋白酶E 0.04 mg/ml)循环灌流，大约20 min后，将心脏从Langendorff装置上取下，置入室温KB液中，将心室组剪碎并用吸管缓慢吹打，获得单个心室肌细胞。将上清液用200目的滤网过滤，室温保存备用。整个灌流系统温度保持在37℃，所有的灌流液和KB液均通以100% O2饱和30 min以上。豚鼠心肌细胞的分离方法基本相同。

1.2.2 全细胞膜片钳实验记录：吸取少许富含细胞的KB悬液于0.5 ml的灌流槽中，静置5～10 min，待细胞沉底附壁后，用100% O2饱和的细胞外液进行表面灌流5～10 min，流速1～2 ml/min。在倒置显微镜(Olympus IX70)下选择边缘清楚、表面光滑、横纹清晰、无收缩的细胞。在22～24℃室温下，采用Hamill等［5］的标准全细胞膜片钳记录方法，记录通道电流。膜片钳放大器通过A/D和D/A数据转换后同计算机连接。刺激信号及电压、电流输入信号的采集由软件(pclampex10.0)控制。玻璃毛胚管经微电极拉制仪(p97，美国sutter公司)拉制而成，经抛光仪(MF830，日本Narishige公司)抛光后尖端直径2～3 μm。充灌电极内液后入水电阻为1.5～3 MΩ，补偿液接电位后，形成高阻封接(giga seal)。补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。电容测定时给予-10 mV阶跃的刺激，用Cm=τ·Iss/△V求膜电容。调节慢电容补偿和串联电阻补偿80%～90%以减少瞬时充放电电流和钳位误差。信号经截止频率为1kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样率为10 kHz。在记录时，为避免电流的衰减(run down)现象影响，电极内液中加入ATP，并控制实验在细胞破膜后25 min内完成。记录方法为破膜后稳定5 min记录给药前的电流值，给药5 min后记录药物作用下的电流值。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(电流/电溶，pA/pF)表示。

1.2.3 各电流刺激方案设定及观察指标： (1)记录IK1时刺激方案。维持电位(Vh)-40 mV，指令电位-120～0 mV，阶跃10 mV，钳制时间400 ms，刺激频率0.2 Hz；以测试电压-100 mV的IK1稳态电流密度在用药前后的变化作为观察指标。(2)记录Ito电流电压关系时刺激方案。维持电位(Vh)-90 mV，先给予-40 mV 20 ms的前刺激，再给予-40～+60 mV的去极化刺激，阶跃10 mV，钳制时间400 ms，刺激频率0.2 Hz；以测试电压60 mV的Ito峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标。(3)记录Ito稳态失活的刺激方案。维持电压-90 mV，给予400 ms，从-120～+60 mV，阶跃10 mV的前刺激，然后钳制在60 mV 300 ms记录Ito电流，并比较用药前后变化。(4)记录Ito失活后时间依赖性恢复的刺激程序。采用双脉冲刺激，维持电压-90 mV，继而先后给予两个去极化到60 mV持续200 ms的去极化刺激P1、P2，其时间间隔△t依次增大分别设为1，3，5，7，10，15，20，30，40，60，90，120，150，180，210，250，300(ms)。记录P2对应的峰电流I。以I/Imax对△t做出稳态失活后恢复曲线。(5)测定Ik的电压依赖性激活。Vh＝-40 mV，从-40 mV 逐渐去极化至+60 mV，阶跃10 mV，刺激波宽为5 s，回到Vh持续2.5 s记录尾电流。(6)测定Ik尾电流的时间依赖性激活(envelope of tails test)：Vh=-40 mV，去极化至+50 mV 后回至Vh，连续10个脉冲，每个脉冲刺激波宽分别为500～5 000 ms，以500 ms幅度逐渐递增。

1.3 数据分析与统计原始电流数据采用Clampfit 10.0(美国Axon公司)进行测量采集，使用Origin 6.0数据处理软件(美国Microcal Software公司)对采集后数据进行分析、拟合和作图。计量数据以均数±标准差(±s)表示，给药前后采用配对t检验，以P＜0.05为差异有显著意义。

2 结果

2.1 参松养心胶囊对大鼠心肌细胞膜IK1的作用采用记录IK1时刺激方案，在大鼠单个心室肌细胞上能记录到一个快速激活的内向电流，在400 ms内无明显失活(见图1 A)。该电流能被1 mmol/L BaCl2完全阻断，表明该电流为IK1。IK1电流内向成分随去极化而减小，反转电位约-40 mV,具有内向整流特性。用钾外液溶解参松养心胶囊提取干粉配制成的0.5%溶液，对IK1有抑制作用(见图1 B)。-100 mV时用药前平均峰值电流密度为(-10.8±1.8)pA/pF，用药后平均峰值电流密度为(-7.18±2.05)pA/pF，平均抑制率为33.1%±16.9%(n=11，P＜0.05)。以各脉冲下电流密度幅值对相应膜电位作图得电流密度-电压(IV)曲线。药物在每一指令电压水平上都减小IK1电流密度，但基本不改变反转电位和曲线的形状。

2.2 参松养心胶囊对大鼠心肌细胞膜Ito的作用

2.2.1 参松养心胶囊对Ito IV曲线的影响：采用记录Ito电流—电压关系时的刺激方案，在大鼠心室肌细胞记录到外向钾电流包括2种成分：一种是快速激活和灭活的瞬时电流(Ito)，电流呈“A”型，峰形尖锐，从0 mV开始激活，电流在10 ms左右达到高峰，之后迅速失活在200 ms内基本达稳态。其激活和失活过程均呈电压和时间依赖性。该电流能被2 mmol/L的4AP完全阻断，表明该电流为Ito。另一种成分为持续电流(Imaintained)，从-10 mV开始激活，在-10～60 mV范围内，随电压增大而增大(见图2A,C)。以各脉冲下电流密度幅值对相应膜电位作图得IV曲线。以峰值电流幅值减去维持电流得到瞬时电流，即Ito。0.5%参松养心胶囊溶液对Ito电流有抑制作用，在0～60 mV测试电压下表现为峰值电流的下降，IV曲线下移。在60 mV的平均电流密度从(-19.8±7.1)pA/pF降至(-10.0±3.93)pA/pF，平均抑制率为(50.6±10.8)%(n=6，P＜0.05)(见图2D)。对Ito电流的失活部分用单指数方程进行拟合，可得到时间依赖性失活的时间常数(τ)。参松养心胶囊可以加速电流的失活(见图3)，用药前后的τ值分别为(29.1±4.7)和(21.4±3.1)(n=6，P＜0.05)。

2.2.2 参松养心胶囊对Ito稳态失活曲线的影响：采用记录Ito稳态失活的刺激方案，并比较用药前后变化。从引出的电流图中可以看到外向电流的失活分为2个过程，首先是维持电流的失活，失活电压较低，继而是峰电流的失活，失活电压要高于前者。Ito的幅值由峰电流与测试脉冲末端测量的维持电流间的差值决定(图4C)。标准化各电流幅值,以相对电流对各膜电位作图得稳态失活曲线。并用Boltzmann 方程I/Imax=1/｛1+exp〔(Vm-V1/2)/k〕｝拟合求出半失活电压(V1/2) 及失活曲线斜率因子(k)(图4D)。0.5%的参松养心胶囊干粉提取溶液可使得Ito稳态失活曲线左移，斜率变大。用药前后的V1/2分别为(-15.67±2.52)mV和(-26.45±3.88)mV，k值从3.41±0.67变为6.38±2.02(n=7,P＜0.05)。

　 2.2.3 参松养心胶囊对Ito失活后恢复曲线的影响：采用记录Ito失活后时间依赖性恢复的刺激程序，用单指数方程拟合曲线得到恢复曲线的时间常数(τ)。当药物浓度0.5%时可以使得恢复时间从(12.9±0.3)延长到(18.5±3.8)(n=5,P＜0.05)(见图5)。

2.2.4 参松养心胶囊对豚鼠心室肌细胞Ik的作用：参松养心胶囊对IK电流有电压依赖性抑制作用(在Vh=-40 mV，阶跃10 mV逐步去极化到60 mV,持续5 s，在豚鼠单个心室肌细胞，记录的电压依赖和时间依赖激活的外向电流IK，图6C)。以VT=50 mV记录的IK为观察指标，当药物浓度0.5%时可以使尾电流峰值电流密度下降(30.8%±1.1)%(n=5，P＜0.05)。采用envelope 刺激方案时记录随时间激活的IK尾电流,以及药物对时间依赖性激活的Ik的抑制作用。

3 讨论

　　动作电位和静息电位是细胞膜上多种离子通道顺序开关、综合作用的结果［6］。细胞膜离子通道电流的异常改变是形成各种心律失常的最重要因素。至少有3 种电压依赖的外向钾电流影响心肌复极过程,它们是Ito，通道在超射后立即开放,是1期快速复极的主要成分；在复极2期激活,并与3期起始有密切的联系,对平台期时程起部分决定作用；主要介导终末期复极并维持静息膜电位。在不同种属的心脏,以及心脏的不同部位，上述钾电流的分布和大小不同,它们对动作电位复极过程有不同的贡献。目前发现的Ito包含2种类型，一种为对4AP敏感而对胞内钙不敏感的Ito1,另一种为钙依赖并能被caffeine和CO2+阻断的Ito2［7］。在本研究中，电极液中含高浓度的钙络合剂EGTA(10 mmol/L ),灌流液中含0.15 mmol/L的钙阻断剂CdCl2，因而本研究中记录的Ito不包含Ito2成分。在实验中我们观察到参松养心胶囊对Ito有明显的抑制作用，减小Ito可以通过影响动作电位的1期复极而使动作电位时程(APD)延长，这可能是其抗心律失常作用机制之一。此外，Ito也是导致跨心肌壁复极不均一性的主要电流［8］，抑制该电流将减少跨壁复极不均一性,减少跨壁折返微环路的形成，避免尖端扭转型室性心动过速等心律失常的发生。目前临床应用的抗心律失常药物中还没有特异针对Ito1通道的药物。在本研究中，我们用豚鼠单个心室肌细胞观察了药物对Ik电流的作用。我们用测试脉冲5 s后记录的尾电流作为观察指标，这主要代表了Ik中的缓慢激活的成分(IKS)，实际上在心律加快时是IKS在复极过程中起主要作用。我们在实验中看到药物浓度为0.5%时对Ik有抑制作用，这将引起APD延长，有利于药物在心动过速时发挥抗心律失常作用。在本实验中还观察到药物对IKI电流的内向成分有抑制作用，但不改变通道的翻转电位和整流特性，略增大电流的外向成分。虽然用药前后比较这一作用差异无显著意义，但增大IK1电流的外向成分可能使细胞动作电位3相加速复极，有利于稳定细胞膜，消除早期后除极，对触发机制引起的心律失常有抑制作用。综上所述，用参松养心胶囊提取干粉配制的5%溶液，可以电压依赖的方式抑制IK1、Ito、Ik。通过降低心肌细胞的兴奋性和抑制心肌细胞AP的复极过程，延长APD来发挥抗心律失常作用。

　　作者单位： 100037 北京，中国医学科学院阜外心血管病医院心律失常诊治中心(李宁、马克娟、赵新然)；病理与生理实验中心(浦介麟)； 050035 石家庄，河北医科大学医药研究院(霍有萍)